病原微生物检测

背景介绍

感染性疾病是临床常见的多发病，是全球死亡率和发病率最高的疾病之一。广义的感染性疾病包括所有病原微生物感染引起的疾病，这些病原体以病毒和细菌为代表，其余还包括立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、寄生虫等病原体，能够人传人或由患病动物传染至人，引起的人体组织器官的感染。

近代比较典型的包括 14 世纪的黑死病（鼠疫）、16 世纪的天花、19 世纪的霍乱、1918 年的流感大流行等。近 20 多年来，从 2002 年的 SARS、2009 年的甲型 H1N1 流感、2013 年的埃博拉病毒、2015 年的寨卡病毒到 2019 年的新型冠状病毒，重大传染病的发生频率没有发生明显的变化，平均 3~5 年一次。除了以上的大规模流行性传染病之外，包括流感、艾滋病、肝炎、结核病、疟疾、梅毒等在内的传染病也对人民的生命健康造成不同程度的危害。

这些疾病广泛存在于临床各个科室中，如ICU，外科、心血管科、神经科、呼吸科、血液科、泌尿科、内分泌科等，一直以来都是人类健康的重要威胁。鉴定病原体是传染病诊疗的基础。如果无法获得准确的病理学诊断依据，将会加重耐药危机，延误治疗。目前主要的病原体诊断技术包括 : 培养、免疫学检测、核酸检测、质谱。

对于感染性疾病，病原微生物的诊疗已成为临床医生及感染控制工作者共同关注的焦点，主要包括及时正确地进行感染源的诊断以及从抗菌谱与抗菌作用、药理特性和不良反应等方面选择合适的抗菌药物两方面。病原微生物检测可以从病原体种类、药敏以及毒力等因素评估感染情况，从而为感染性疾病的治疗及预防提供重要参考和关键依据，临床也迫切需要更精准的病原微生物检测技术来应对感染性疾病的威胁。

基因层面的检测技术能够改善传统检测过程中应用外部形态和生理特征进行检测的现状，能够采用特有的基因片段序列对病原微生物的种类进行鉴别，所以基因检测技术以其自身独到的优势被临床医学检验领域广泛应用。

基因检测技术

聚合酶链反应(PCR)

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外是用已知寡核苷酸引物引导未知片段中微量待测基因片段并进行扩增的技术。由于PCR可以对待测基因进行扩增，特别适用于病原体感染早期的诊断。PCR技术在近20年里发展迅速，从基因扩增到基因的克隆和改造以及遗传分析，可靠性逐步提高。

宏基因组测序（mNGS）

宏基因组测序是一种用于研究环境或生态系统中微生物群体的基因组组成和功能的技术。与传统的基因组测序（也称为微生物组）不同，宏基因组测序能够同时分析多个不同种类的微生物的基因组。在宏基因组测序中，科学家采集样本并提取其中的微生物DNA。接下来，通过高通量测序技术将DNA片段测序得到大量的DNA序列数据，推断微生物群体的组成、功能和相互作用等信息。

宏基因组测序（mNGS）首先对感染样本中的全部微生物的核酸进行提取和前处理，基于二代测序平台进行测序快速获得样本中的核酸序列，进一步通过数据库比对和智能化算法分析各个疑似致病微生物的种属信息，从而无偏性对检测样品中病原微生物进行定性和定量分析。

mNGS可以用于细菌、真菌、寄生虫和各种病毒的感染，主要是针对感染样本中提取的核酸进行测序比对的过程，在许多领域有广泛应用，例如环境科学、生物技术和人类健康研究等。通过了解微生物群体的组成和功能，我们可以深入了解生态系统的运作机制，以及微生物在环境和人体中的作用。这对于生态学、疾病研究和生物资源管理等领域具有重要意义。

16S rRNA的检测技术

16S rRNA测序是一种常用的分子生物学技术，用于研究微生物群落的组成和多样性。它基于对细菌和古菌等微生物领域中普遍存在的16S rRNA基因序列的测序和分析。在16S rRNA测序中，首先需要从样本中提取微生物的总DNA。然后，使用引物对16S rRNA基因进行PCR扩增，以获得包含变异区域的DNA片段。接下来，这些片段将经过高通量测序技术进行测序，生成大量的16S rRNA序列数据。

16S rRNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴定、分类的热门检测技术。16SrRNA检测技术利用现有病原菌标准菌株制作DGGE(变性梯度凝胶电泳)标准marker，然后对疑似“病原菌”扩增16SrRNA进行DGGE分析，这样可以做到快速检测。揭示不同环境样品或生物体中存在的微生物群落的组成，了解微生物在不同生态系统中的作用，以及微生物群落与宿主健康之间的关系等。这在微生物生态学、医学和环境科学等领域具有广泛的应用。

tNGS检测技术

中国食品药品检定研究院 2022 年 6 月《关于开展病原靶向测序多重核酸检测技术质量评价联合研究的通知》，提出：“tNGS 通过超多重 PCR 扩增与高通量测序两种技术的结合，能够对待测样本中几十种至几百种已知病原微生物及其毒力和 /或耐药基因进行检测。在低浓度的病原微生物的检测，特别是其毒力和 / 或耐药基因检测方面，tNGS 相对 mNGS具有病原谱范围明确、测序成本低等优势，在临床检验领域正受到越来越多的关注”。

tNGS 的核心是超多重 PCR，可以做到 300~400 重，对比普通 PCR 的10重和芯片杂交的50重，在灵敏度和特异性上有较大优势；技术关键是核酸提取效率和 PCR 扩增体系的效率；相对 mNGS，tNGS 的价格优势可以聚焦病种 panel，覆盖一部分呼吸道多联检的市场，但不能替代，仍需进一步的规范化和市场推广。

常见病原体样本

革兰氏阳性菌

猪链球菌、草绿色链球菌、变形链球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、缓症链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、婴儿链球菌、厌氧消化链球菌、咽峡炎链球菌、唾液链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、鸟肠球菌、马肠链球菌、头状葡萄球菌、人形葡萄球菌、溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌、纹带棒状杆菌、鼠李糖乳杆菌、惰性乳杆菌、产气荚膜梭菌、败毒梭菌、第三梭菌、反硝化金氏菌、诺卡菌属、惠普尔养障体、大芬戈尔德菌、单核细胞增生李斯特菌、鹑鸡肠球菌、鼻疽诺卡氏菌、脓肿诺卡菌、星状诺卡菌、巴西诺卡菌、盖尔森基兴诺卡氏菌、豚鼠耳炎诺卡菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、中间链球菌、胞内分枝杆菌、蟾分枝杆菌、龟分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、中间链球菌

革兰氏阴性菌

铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜水气单胞菌、产碱假单胞菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、百日咳鲍特菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、脆弱拟杆菌、惰性凝聚杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、具核梭杆菌、坏死梭杆菌、木糖氧化无色菌、嗜沫凝聚杆菌、脑膜炎奈瑟菌、卡他莫拉菌、伯克霍尔德菌属、布鲁氏菌属、多杀巴斯德菌、嗜肺军团菌、阴沟肠杆菌复合群、粘质沙雷氏菌、中间普氏菌、金格杆菌、害肺戴阿里斯特杆菌、犬咬二氧化碳嗜纤维菌、摩氏摩根菌、大肠埃希氏菌、按蚊伊丽莎白金菌、淋病奈瑟菌、产气克雷伯菌、柯氏柠檬酸杆菌、新洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌、产吲哚金黄杆菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、洋葱伯克霍尔德菌、脑膜脓毒性尹丽沙白菌、死亡梭杆菌、大肠弯曲杆菌

真菌

白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔氏念珠菌、解脂念珠菌、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌、黑曲霉、黄曲霉、焦曲霉、米曲霉、土曲霉、烟曲霉、头状地霉菌、马尔尼菲篮壮菌、镰刀菌属、格特隐球菌、罗伦特隐球菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、微小根毛霉、小孢根霉、荚膜组织胞浆菌、尖端赛多孢子菌、阿萨希毛孢子菌

DNA 病毒

人多瘤病毒1型（BK病毒）、人多瘤病毒2型（JC病毒）、默克尔细胞多瘤病毒、人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型、水痘带状疱疹病毒（人疱疹病毒3型）、EB病毒（人疱疹病毒4型）、巨细胞病毒（人疱疹病毒5型）、人疱疹病毒6型、人博卡病毒、腺病毒、人类腺病毒B、人疱疹病毒7型、人疱疹病毒8型、人类多瘤病毒3型（KIPyV）、人类多瘤病毒（Wu病毒）、伪狂犬病病毒

RNA 病毒

肠道病毒属、肠道病毒71、鼻病毒属、人类偏肺病毒、日本乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒、基孔肯尼病毒、人类冠状病毒229E、人类冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、埃可病毒、狂犬病病毒、登革热病毒、人类免疫缺陷病毒、甲型流感病毒（H1N1)、甲型流感病毒（H2N2）、乙型流感病毒（Victoria）、乙型流感病毒（Yamagata）、丙型流感病毒、人类冠状病毒HKU1、人类冠状病毒NL63、SARS病毒（SARS-CoV）、新型冠状病毒（COVID-19)、人副流感病毒1型、人副流感病毒4型、人鼻病毒A型、人鼻病毒B型、人鼻病毒C型、轮状病毒属、诺如病毒、人副肠孤病毒1型（HPeV-1)、人副肠孤病毒3型（HPeV-3)、人副流感病毒3型

寄生虫

田鼠巴贝虫、亚洲带绦虫、曼氏迭宫绦虫、广州管圆线虫、刚地弓形虫、恶性疟原虫、细粒棘球绦虫（包虫）、粪类圆线虫、卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、溶组织内阿米巴原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、著带绦虫

特殊病原体

立克次氏体、猫立克次氏体、普氏立克次氏体、恙虫病东方体、鹦鹉热衣原体、问号钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体、梅毒螺旋体、肺炎支原体、微小脲原体、沙眼衣原体、解脲脲原体、汉赛巴尔通体、贝纳柯克斯体、肺炎支原体、人型支原体

背景介绍

基因检测技术

常见病原体样本

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